细菌纤维素在组织工程中的应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.03.015

摘要/Abstract

摘要：

背景：细菌纤维素是纳米级纤维，具有许多独特的理化和机械性能及良好的生物相容性和可降解性等特性，目前已成为国际上新型组织工程材料的研究热点。
目的：分析细菌纤维素在组织工程中的应用。
方法：检索2004至2013年PubMed数据库和中国知网数据库中相关文献，英文检索词为“bacterial cellulose; tissue engineering”，中文检索词为“细菌纤维素；组织工程”。选取有关细菌纤维素在组织工程中应用方面密切相关文献48篇进行分析。
结果与结论：细菌纤维素具有高结晶度、高持水性、高机械强度、可降解性、良好的生物相容性和超细三维纳米网状纤维结构等独特特性，能作为生物活性分子的载体，维持生物活性分子的活性。同时，细菌纤维素通过改性修饰能提高其机械和生物特性，促进损伤组织的修复重建。目前已开始将细菌纤维素应用于组织器官重建中。细菌纤维素能作为生物活性分子的载体，但存在难以降解和功能单一等缺点，通过对细菌纤维素的改性修饰可以改善它的功能和促进降解。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 纳米材料, 细菌纤维素, 组织工程, 改性修饰, 皮肤组织工程, 血管组织工程, 骨组织工程, 生物活性分子的载体

Abstract:

BACKGROUND: Because of unique physiochemical and mechanical properties and good biocompatibility and degradability, bacterial cellulose, a nanofiber, has a potential as an ideal tissue-engineered material.
OBJECTIVE: To retrospectively analyze the application of bacterial cellulose in tissue engineering.
METHODS: The first author researched PubMed and CNKI databases (2004/2013) to retrieve articles about application of bacterial cellulose in tissue engineering. The keywords were “bacterial cellulose; tissue engineering” in English and Chinese, respectively. Totally 48 relevant articles were analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: Bacterial cellulose has unique properties, such as, high crystallinity, high mechanical strength, high water holding capacity, biodegradation, biocompatibility and three-dimensional nano network. In addition, bacterial cellulose can maintain biological activity of bioactive factors as a carrier. At last, modified bacterial cellulose can improve its mechanical and biological properties, and promote the repair and reconstruction of the tissue and organ. Currently, bacterial cellulose has been used in tissue and organ reconstruction. Bacterial cellulose as a carrier for bioactive molecules is difficult to degrade and has disadvantages of single function, which can be modified to improve its function and degradation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: biocompatible materials, cellulose, nanofibers, stents

中图分类号:

R318

黄建文，徐月敏. 细菌纤维素在组织工程中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(3): 420-425.

Huang Jian-wen, Xu Yue-min. Application of bacterial cellulose in tissue engineering[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(3): 420-425.

图/表（结果） 1

2.1 细菌纤维素在皮肤组织工程中的应用 为了探讨细菌纤维素在皮肤损伤治疗中的应用，Sanchavanakit等^[12]研究者将人角化细胞和人成纤维细胞种植于细菌纤维素膜上，观察这两种细胞在细菌纤维素膜上的生长、平铺和迁移情况，从而评估细菌纤维素膜的潜在生物作用机制。同时，他们也研究了细菌纤维素膜的物理、机械特性。结果显示细菌纤维素膜的平均孔径和表面积分别是22.4 nm，12.62 m²/g；细菌纤维素膜的持水性很强且具有很高机械强度；细菌纤维素膜没有细胞毒性，支持角化细胞和成纤维细胞的生长和增殖，但角化细胞在细菌纤维素膜呈平铺样生长，细菌纤维素膜促进角化细胞的迁移，而成纤维细胞呈簇状生长；同时，RT-PCR显示角化细胞的特异标记物E-钙黏素和α-3粘连蛋白基因在角化细胞内表达，这表明细菌纤维素膜能支持和维持角化细胞的特征。故研究者们认为细菌纤维素膜与角化细胞的相容性要优于成纤维细胞，再上皮化过程可能是细菌纤维素膜有利于皮肤伤口愈合的机制，成纤维细胞不易在细菌纤维素膜上黏附可能有利于抑制皮肤瘢痕的形成。同时，国内外学者也曾报道细菌纤维素对皮肤创伤促愈合和抑制皮肤瘢痕方面的相关实验研究^[13-15]。

2.2 细菌纤维素在血管组织工程中的应用 近几年来，细菌纤维素在血管组织工程中的研究较为迅速。Esguerra等^[5]将细菌纤维素植入仓鼠背部皮肤褶室内，评估其生物相容性和血管化作用。结果表明细菌纤维素的相容性良好，周围出现血管化反应。此研究为细菌纤维素作为血管组织工程材料提供了体内研究基础。

Backdahl等^[16]将人平滑肌细胞种植于细菌纤维素膜上，在体外观察细胞在细菌纤维素膜的黏附、增殖和渗透情况，评估细菌纤维素膜的机械特性，并将猪颈动脉和膨体聚四氟乙烯材料作为对照组。扫描电镜显示细菌纤维素膜两面结构呈不对称性，近气液交界面的细菌纤维素膜表面呈致密状，而反面呈疏松的空隙状。细菌纤维素膜的纳米纤维直径约100 nm，其网状结构与天然胶原结构相似。对比细菌纤维素、猪颈动脉和膨体聚四氟乙烯材料的机械强度，发现细菌纤维素与猪颈动脉相似，这可能是由于相似的纳米纤维网状结构所致；在断裂拉力、断裂张力和杨氏模量方面，猪颈动脉优于细菌纤维素。同时，此研究显示平滑肌细胞较好地黏附于细菌纤维素膜表面，在细菌纤维素上增殖并渗入膜内。当培养基中加入生长因子(血小板衍生生长因子BB)时，细胞渗入至细菌纤维素膜内的距离更大，体外培养2周后，细胞渗入40 μm，且在不同层次均有细胞渗入，而致密面仅渗入1-5 μm。由于细菌纤维素膜满足了组织工程支架的一些基本要素，所以细菌纤维素可能作为血管组织工程支架材料。

因为顺应性的不匹配是移植血管内膜增生的主要原因之一，所以为了评估管状细菌纤维素的机械特性是否能满足组织工程人工血管的需要，Zahedmanesh等^[17]通过膨胀实验和单轴拉力试验来检测管状细菌纤维素的机械特性，同时观察牛平滑肌细胞和内皮细胞在细菌纤维素中的生长情况。研究结果显示管状细菌纤维素平均顺应值为4.27×10^-2%/mm Hg(压力在30-120 mm Hg之间，1 mm Hg=0.133 kPa)，这与常用的自身血管移植的人大隐静脉相似。同时，组织学和荧光图像分析显示平滑肌细胞和内皮细胞的黏附性和细菌纤维素相容性良好；管状细菌纤维素的外腔表面的孔隙率大，平滑肌细胞渗入细菌纤维素内的距离达100 μm，由于内腔表面的孔隙率小，平滑肌细胞渗入的数量少，细胞呈融合样黏附于内腔表面。考虑到平滑肌细胞和内皮细胞均能在细菌纤维素表面呈融合样生长、增殖和渗入，所以管状细菌纤维素可能作为一种潜在的血管组织工程材料^[4^，¹⁶^，^18]。

因为细菌纤维素具有独特的理化、机械和生物特性，Wippermann等^[19]将中空管状细菌纤维素移植入猪体内，替代颈动脉，3个月后通过组织学分析和电镜观察评估细菌纤维素的慢性炎症反应、异物排斥反应及细胞生长和管腔的通畅情况。植入3个月后，管状细菌纤维素的通畅率为87.5%(8例中有1例管腔堵塞)。细胞平滑地移向移植管腔内表面，发生内皮化，且在管状细菌纤维素壁形成与正常血管相近的3层结构(内层：内皮细胞和基底膜；中层：胶原和平滑肌；外层：纤维细胞)。同时，没有出现明显的炎症反应和异物排斥反应。

2.3 细菌纤维素在软骨组织工程中的应用 损伤的关节软骨再生能力差，必需要进行治疗，而组织工程为软骨的再生与修复提供一个理想的选择。细菌纤维素材料由于具有高机械强度、原位可塑性、良好的生物相容性和制备简单等优点，是软骨组织工程的一种理想支架。Svensson等^[20]应用牛软骨细胞评估天然和化学修饰细菌纤维素材料的特性，并与天然胶原相比。结果显示天然细菌纤维素促细胞增殖作用近似胶原的50%，但优于细胞培养塑料和海藻酸；修饰细菌纤维素能增加对细胞的黏附作用，但没有促进细胞的生长，也没有对细胞的增殖产生影响；同时，TEM显示非修饰细菌纤维素支持细胞的增殖，细胞渗入至支架内；在细菌纤维素的机械特性方面，天然细菌纤维素的弹性模量与关节软骨在同一范围内，拉伸强度优于胶原，表明细菌纤维素的机械强度能满足组织工程软骨的需要。

Bodin等^[21]利用细菌纤维素制备成半月板样结构，评估其力学性能，并将其与猪半月板和用于临床半月板修复的胶原进行比较。结果显示细菌纤维素杨氏模量为1 MPa，优于胶原材料100倍；当压缩强度为2 MPa时，细菌纤维素杨氏模量是胶原的5倍，与半月板相似；在更强的压缩强度下，猪半月板更强壮，这差异归因于半月板的胶原纤维结构排列更有序、规则。结合细菌纤维素的价格低廉、能制备成半月板样结构以及能促进软骨细胞迁移等优点^[20]，研究者认为细菌纤维素可作为一种潜在的支架材料用于半月板的修复。

相对致密的细菌纤维素纳米纤维结构限制了细胞的迁移，因此，Andersson等^[22]利用150-300 μm石蜡制孔颗粒制备细菌纤维素支架，将人软骨细胞种植于有孔支架上评估细胞的行为。扫描电镜显示细菌纤维素支架内表面比外表面致密，形成许多广泛联系的孔隙。体外培养24 h后，共聚焦显微镜显示软骨细胞出现在整个支架表面，并向支架内生长，随着时间的延长，支架内细胞数量不断增加，在高孔隙率支架中，细胞渗入深度达100 μm。同时，DNA分析表明软骨细胞在孔隙细菌纤维素支架内增殖生长，Alcian blue van Gieson 染色发现在细胞聚集区域软骨细胞产生细胞外基质成分，且细胞数量越多，细胞外基质产生也越多。

近年来，细菌纤维素用于关节软骨修复的研究越来越受到研究者们的重视，但有关研究细菌纤维素摩擦特性的文章非常少见。Lopes等^[23]为了研究细菌纤维素摩擦特性，将细菌纤维素膜与牛关节软骨相互接触、滑动，评估细菌纤维素膜的摩擦系数和磨损量。相互摩擦开始时，摩擦系数突然升高至0.1，然后持续下降至0.05。即使在不同的接触压力下，摩擦系数保持在一个稳定的状态下。扫描电镜和能谱仪显示，随着摩擦时间的延长，细菌纤维素膜厚度变薄，慢慢失去了原有的光滑度。虽然细菌纤维素膜的滑动表面有缺损，但是对测的关节软骨没有发生损失，这表明细菌纤维素/天然软骨可以作为体内应用的摩擦系统，低的摩擦系数及细菌纤维素与牛关节软骨接触面的维持支持细菌纤维素用于修复关节软骨。

2.4 细菌纤维素在骨组织工程中的应用骨疾病能导致大量的组织缺损，需要自体或同种异体骨组织替代治疗。但自体或异体组织移植往往存在一些缺点，如取材部位的并发症、疾病的传播等。组织工程为骨组织的再生提供了一种理想的选择，细菌纤维素由于具有良好的生物相容性和机械特性而适应于骨组织工程。细菌纤维素细菌纤维素孔径大于300 μm的支架更有利于促进骨骼和毛细血管的形成。Zaborowska等^[24]将300-500 μm的石蜡微球加入细菌纤维素的制备过程中，然后将微球过滤，形成具有微米孔径的支架，并将鼠成骨细胞种植于支架上进行体外培养。扫描电镜显示，加入致孔剂的细菌纤维素具有微米孔径(300-500 μm)，孔隙之间存在直径为100 μm的相互交通的隧道，而未加入致孔剂的细菌纤维素孔径为纳米级别。细菌纤维素支架的最大杨氏模量约1.6 MPa，能满足非承重部位骨组织缺损需要。共聚焦显微镜和组织学分析显示细胞分布在微米孔径细菌纤维素和纳米孔径细菌纤维素上，均呈融合生长，但在微米孔径细菌纤维素表面分布的细胞更密集，孔隙内的细胞浓度更高，沉积的矿物质浓度更高。此研究表明微米孔径细菌纤维素支架更有利于修复骨缺损。近期，Brackmann等^[25]也将骨祖细胞种植在微米孔径细菌纤维素支架上，通过非线性显微镜技术(SHG和CARS显微镜)观察细胞在支架上的生长和胶原合成情况，并与传统组织染色技术比较。研究结果显示两种技术均能观察到细胞在支架上和向支架内渗入生长，支架内的胶原与细胞数量随着培养时间的延长而增加。因此，微米孔径细菌纤维素支架能支持骨祖细胞的生长，诱发骨再生。同样，Favi等^[26]利用马骨髓间充质干细胞作为种子细胞，种植于细菌纤维素水凝胶支架上，评估细胞在支架上黏附、增殖和分化情况。研究表明细胞与细菌纤维素支架的相容性良好，支持细胞的黏附与增殖，并有利于细胞分化为骨、软骨细胞，证实了细菌纤维素支架与骨髓间充质干细胞的组合应用于骨骼组织工程中具有广阔的前景。

2.5 细菌纤维素作为生物活性分子的载体 透明质酸作为人骨基质的基本无机要素，具有生物相容性、生物活化和促骨生长的优点。但是，透明质酸的机械稳定性差和易碎，从而限制了其在骨缺损修复中的应用。为了克服透明质酸的不足之处，研究者将细菌纤维素先后浸泡在CaCl₂溶液和体液模拟溶液中，制备复合材料细菌纤维素-透明质酸^[27]。扫描电镜显示细菌纤维素表面分布有球状颗粒，成分分析为含有碳酸盐的磷灰石。为了研究细菌纤维素-透明质酸复合支架在骨修复中的作用，研究者将细菌纤维素-透明质酸或种植细胞的细菌纤维素-透明质酸进行体内、外实验^[28-31]。研究表明复合支架生物相容性良好，能促进骨细胞的生长、增殖和分化，并且其促骨生成作用优于单纯细菌纤维素。同时，含有透明质酸和PLGA的细菌纤维素复合材料具良好的力学性能、孔隙率和生物相容性,有望作为一种新型组织工程支架材料^[32]。

Shi等^[33]为了探讨细菌纤维素能否作为生长因子骨形态发生蛋白2的装载体及载有骨形态发生蛋白2的细菌纤维素能否促进骨组织的再生，他们将不同浓度的骨形态发生蛋白2滴入至细菌纤维素支架上，进行体内、外实验。结果表明，在体外，装载骨形态发生蛋白2的细菌纤维素支架能促进鼠C₂Cl₂细胞分化成骨细胞，促进骨的生成。同时，细菌纤维素能降低骨形态发生蛋白2的弥散而保持生长因子的活性；在体内，细菌纤维素支架能促进细胞的渗透和骨生成。所以，细菌纤维素/骨形态发生蛋白2具有潜在促骨再生的临床应用价值。

2.6 改性细菌纤维素在组织工程中的应用随着细菌纤维素在组织工程中应用的不断推广，对细菌纤维素的功能要求越来越高，研究者发现细菌纤维素分子间作用力强而难以溶解和结构官能团单一而导致功能单一等缺点，限制了它的应用。所以，研究者们通过各种方法对细菌纤维素材料进行改性修饰，以达到提高细菌纤维素材料机械特性和生物活性的目的。

2.6.1 生物改性在细菌纤维素的合成过程中向培养基中添加一些含有其他官能团的分子或单元作为碳源进入微生物代谢的途径，合成具有添加物结构的改性细菌纤维素材料，即为生物改性。Grande等^[34]将羧甲基纤维素加入产细菌纤维素的细菌培养中，增加了培养基的黏附性，使透明质酸粉末颗粒能悬浮于培养基中，而不至于沉积于底部，从而达到制备细菌纤维素-透明质酸复合材料的目的。研究表明引入羧甲基纤维素使细菌纤维素纤维素的直径较未修饰纤维素的减小50%，细菌纤维素的孔径增加了47.8%，增加了细菌纤维素上HEK细胞的活力，并保持了细菌纤维素原有的生物相容性。研究者们在细菌纤维素细菌发酵培养基中加入微米大小的致孔颗粒(石蜡)，制备成具有多孔细菌纤维素。通过致孔剂的修饰，细菌纤维素支架具有微米级别的孔径，甚至能达到500 μm，孔隙的相互沟通性优于纳米孔径支架。微米细菌纤维素支架能促进种植细胞的生长、增殖、分化和渗透，并且调节了细菌纤维素的机械特性^{[24, 35-36]}。另外，Hirayama等^[37]在细菌纤维素的制备过程中，将钙/海藻酸水凝胶包裹产细菌纤维素细菌形成细菌纤维素微束，微束上种植细胞构建一种细胞结构单位，通过绕圈和旋转系统形成由结构单位构成的圈状和纱线样结构，该结构为细胞提供了相互接触的三维结构，有利于生理必需物质，如氧气、糖和蛋白质分子的交换，对于细胞的功能和分化发挥着重要作用。

2.6.2 化学改性在分离得到纯细菌纤维素后对其进行溶解后进行化学改性或直接进行表面改性制备纤维素衍生物，即化学改性。相比于生物改性，化学改性合成衍生物目标明确，不受试剂种类的限制且反应时间短，也是一种很有开发潜力的细菌纤维素改性途径。Pertile等^[38]将两种重组蛋白(IKVAV和RGD)加入细菌纤维素支架上，通过细菌纤维素吸收重组蛋白，增加了支架对细胞的黏附性和促进了细胞的增殖。同样，通过磷酸化和磺酸化修饰细菌纤维素支架，使支架对软骨细胞的黏附性较未修饰支架更强，细胞呈平铺样生长。Li和Bodin两组研究者^[39-40]分别通过高碘酸和臭氧氧化修饰细菌纤维素支架，高碘酸修饰能增加细菌纤维素支架的降解性和孔径大小，适合细胞的生长；臭氧氧化诱导丙烯酸修饰细菌纤维素，使细菌纤维素发生磷酸钙晶体化现象，晶体化的细菌纤维素复合支架有望成为组织工程骨再生的有用材料。由于成骨生长肽和成骨生长肽末端五肽成骨生长肽(10-14)能促进骨祖细胞和骨髓间充质细胞的分化和促进骨生成的作用，故Saska等^[41]将成骨生长肽和成骨生长肽(10-14)修饰细菌纤维素。修饰细菌纤维素能促进成骨细胞的增殖，有利于钙沉积，有促进骨生成的作用。研究者们将胶原或明胶与细菌纤维素通过交联法制备复合细菌纤维素材料，修饰细菌纤维素能促进细胞的黏附、生长，同时能改善支架的生物相容性^[42-43]。

2.6.3 复合改性纯化后细菌纤维素与其他材料直接复合制备细菌纤维素复合材料，即复合改性。复合改性相对于前两种改性方法来说，操作更加简单环保，能在一定程度上改善细菌纤维素的力学、光学、细胞黏附等性能。蔡志江等^[44]将细菌纤维素水凝胶膜直接与明胶溶液结合成细菌纤维素-明胶复合多孔支架。结果表明，复合细菌纤维素支架的表面孔径变大，孔隙率下降，但依然呈三维网络结构；同时，复合支架更有利于细胞的黏附、生长和增殖。Millon等^[45-46]将PVA粉末加入细菌纤维素悬液中，形成一定溶度的混合物，然后将混合物倒入一模具中，经过加热-冷冻循环法制备成PVA-细菌纤维素复合支架。此复合支架的机械强度变化范围广，可以制备成与猪心瓣膜、动脉的机械强度相似的支架，用于心血管、软组织的替代治疗。由于体内缺乏细菌纤维素降解所需要的酶，所以细菌纤维素在体内难以被降解。Hu等^[47]将缓冲液和纤维酶先后滴入至细菌纤维素支架上，冻干后在不同溶液中观察支架的降解情况。结果表明缓冲液有利于保持纤维酶的活性，结合缓冲液的细菌纤维素的糖释放量为97%，而未结合的仅为30%。同时，酶修饰细菌纤维素的机械特性(抗拉强度和伸展性)与人皮肤相似。此研究表明，纤维酶的修饰能改善细菌纤维素材料的降解性和机械特性。

2.7 细菌纤维素在泌尿系统组织工程中的应用 细菌纤维素作为组织工程支架主要应用于皮肤、血管、软骨和骨组织等研究中，而在泌尿系统研究中极少见，仅有1篇文献报道了细菌纤维素在泌尿系组织工程中的应用。Bodin等^[48]将尿液来源的干细胞和尿路上皮细胞与平滑肌细胞的共培养细胞分别种植在不同的微米孔径细菌纤维素支架上，在体外静态和动态培养2周后，观察细胞在支架上的生长情况及尿液来源的干细胞的分化。结果显示细胞在支架上呈多层生长并且渗入至支架内，尤其在动态培养时。但转速为10和 40 r/min时，两组的细胞生长层数和渗入没有明显差异；细胞渗透在动态培养下的不同孔径支架之间也没有明显差异。当尿液来源的干细胞增殖到一定数量时，细胞就开始分化为尿路上皮细胞和平滑肌细胞。此研究也将尿液来源的干细胞/细菌纤维素支架植入无胸腺小鼠体内，结果表明支架的相容性良好，没有出现纤维团块等严重炎症反应。因此，此研究表明种植细胞的细菌纤维素支架也可以应用于尿路重建的组织工程中。

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